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本制品为1.1×即用型快速PCR预混液，内含S4 Fidelity DNA polymerase、dNTPs以及优化的缓冲体系，只需添加引物和模板即可进行扩增，可有效扩增5kb以内的DNA片段。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，扩增产物为平末端，可直接用于平末端克隆。

• 操作简单：1.1×即用型预混液，无需添加ddH2O，最大程度地减少实验步骤。
  
• 高保真扩增：保真度为野生型Taq酶的30倍。
  
• 极快的延伸速度：10～15s/kb。
  
• 超高的耐热性能：98℃热处理1h后聚合酶活性无明显变化。

本制品适用于以试剂盒提取的基因组DNA、cDNA和质粒DNA的PCR扩增，如基因鉴定、基因克隆等实验。

• 本制品为1.1×PCR预混液，无需额外添加ddH2O。每次反应中该产品用量至少应占到总反应体积的85%，50μL体系至少使用43μL PCR Mix，25μL至少使用21μL PCR Mix。
  
• 请使用高质量的模板进行扩增，如试剂盒提取的基因组DNA。请勿使用dUTP或含尿嘧啶的引物与模板。
  
• PCR Mix应避免反复冻融，短期内多次使用可置于4℃保存。

• 按下表配制PCR反应体系（冰上操作）
  

  成分	25μL体系	50μL体系	终浓度
  1.1×S4 Fidelity PCR Mix	21～22μL	43～45μL	1×
  引物1 (10μM)	1.0μL	2.0μL	0.4μM
  引物2 (10μM)	1.0μL	2.0μL	0.4μM
  模板DNA	1～2μL	1～3μL

  • 当需要加入较多的模板时，可相应调整本制品用量，但本制品占比不可低于总体系的85%，Mix含量过低会降低扩增效率。本制品推荐45μL/50μL扩增体系。
    
  • 引物终浓度范围为0.2～0.8μM，推荐0.4μM，过少的引物会导致扩增失败或产量极低，过量的引物会增加错配的可能性，导致非特异性扩增。
    
  • 模板推荐量：
    试剂盒提取的基因组DNA：50～500ng；
    质粒、噬菌体DNA：0.05～1ng；
    cDNA：推荐将反转录产物原液稀释5～10倍后，取1～2μL作为模板。
    注：过量的模板会导致非特异性扩增，过少的模板易导致PCR扩增效率低。
• 建议的PCR条件
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	98℃	2min	1
  变性	98℃	10s	30～35
  退火	Tm	10～15s
  延伸	72℃	10～15s/kb
  终延伸	72℃	1～5min	1
  -	4℃	Hold	-

  • 预变性：扩增较长的片段时，建议使用95℃ 5min预变性处理防止对DNA造成额外的损伤；
    
  • 退火温度：参考引物Tm值，最适退火温度与引物间的平均Tm值相近，若引物间Tm值偏差较大，建议退火温度设置为引物中Tm较小值+1～2℃。
    值得注意得是，若引物上添加有与模板不匹配的碱基序列，如酶切位点、同源臂等，PCR程序设置退火温度时，仅需计算与模板特异性匹配的引物序列的Tm值。
    
  • 退火时间：对于含兼并引物、复杂模板的扩增，建议退火时间延长至30s。
    
  • 延伸温度：通常为72℃，可根据实际需求在68～75℃范围内调整。
    
  • 延伸时间：常规模板推荐设置为10~15s/kb，复杂模板可以将延伸速度增加至20~30s/kb；略微增加延伸时间有利于提高长片段、低浓度、复杂模板的PCR产量，但总延伸速度不超过30s/kb。
    
  • 循环数：30个循环可满足大部分扩增需要，循环数过多易导致非特异性扩增，若扩增条带较弱，可将循环数增加至35～40个。

• 扩增无产物或产物量少？
  
  • 模板降解或模板纯度差。电泳检测模板质量，使用高质量模板。
    
  • 模板浓度过低。适当增加模板用量。
    
  • 引物不合适。优化引物设计。
    
  • 退火温度不合适。设置退火温度梯度，摸索合适的退火温度。
    
  • 循环数过少。适当增加5～10个循环。
    
  • 延伸时间不足。复杂模板可适当增加延伸速度至20～30s/kb。
• 扩增出现非特异条带或弥散带？
  
  • 引物特异性差。优化引物，避免非特异性条带以及引物二聚体的扩增。
    
  • 引物浓度过高。降低引物浓度。
    
  • 模板过量或纯度差。减少模板量，使用高质量模板。
    
  • 退火温度过低。适当提高退火温度或使用Touchdown PCR程序。
    
  • 循环数过多。减少循环数至25～30个循环。